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        百家秘籍

        赤橙黃綠青藍紫 誰持彩練當空舞——熒光強度檢測的多功能熒光酶標儀方案-下

         (續熒光強度檢測的多功能熒光酶標儀方案-上) 

        二、濾光片式多功能熒光酶標儀

        2.1 濾光片熒光光路系統的特點

               濾光片光路系統具有高光通量,光損耗少,高信噪比的優點。隨著濾光片新材料的應用和工藝改進,人們已可根據檢測要求對激發、發射光濾光片的截止波長、帶寬進行特殊優化組合(帶寬可以從10- 50nm的大范圍內選擇),以獲得最佳的信噪比。因此,從熒光酶標儀誕生以來,濾光片光路系統就成了熒光檢測的標配,特別是FP、TRF、TR-FRET等對靈敏度要求極高的應用。

               濾光片系統還有一個優勢就是濾光輪可以快速切換濾光片,同步檢測兩種熒光信號,如典型的鈣離子流檢測、BRET雙波長熒光比例分析等檢測,這些都是基于光柵單色器的系統所不能完成的。因此,濾光片熒光檢測系統的應用更廣。

               此外,基于濾光片光路的多功能熒光酶標儀還具有價格便宜的優勢。

               當然,熒光染料檢測光譜特征不同,不同試劑盒、不同應用中的熒光檢測波長不一。而濾光片型酶標儀無論是配置濾光片輪抑或是抽插式濾光片滑條,考慮到發光檢測所需的1個空白位,實際可加載的濾光片至多不過5個。這樣將難以避免有部分實驗會因缺少相應波長的濾光片套件而無法進行。而濾光片單獨購買、更換擦著,卻并非所有品牌機型的新手可輕而易舉完成。

        表2多功能熒光酶標儀標準濾光片配置一覽

        品牌

        型號

        Molecular Devices

        SpectraMax Mini

        Tecan

        Infinite F Plex

        Biotek

        Synergy LX

        BMG

        FluoStar Omega

        Promega

        GloMax Explorer

        熒光模塊

        SpectraMax Mini熒光檢測儀濾光片組件.jpgInfinite F Plex熒光檢測儀濾光模塊.jpgsynergy LX熒光檢測儀熒光濾光方塊filter cube.jpgFluostar Omega熒光檢測儀濾光片輪.jpgGloMax Explorer熒光檢測儀濾光片滑動插件.jpg

        濾光片容量

        1個

        4個

        2個

        8個

        5個

        Blue

        Ex 360/35nm

        Em 465/35nm

        Coumarin/AMC, AF350

        用戶自定義

        Ex 360/40nm

        Em 460/40nm

        (MUB, caspace-3)

        Ex 355/35nm

        Em 460/35nm

        Ex 405nm

        Em 500/5nm

        Green

        Ex 485/20nm

        Em 535/25nm

        (Fluorescein/FITC)

        Ex 485/20nm

        Em 528/20nm

        (Fluorescein,   EGFP)

        Ex 485/20nm

        Em 528/20nm

        (Fluorescein,   EGFP)

        Ex 485/20nm

        Em 528/20nm

        Ex 475nm

        Em 525/25nm

        Red

        Ex 535/25nm

        Em 595/35nm

        (Alamar blue, PI)

        用戶自定義

        EX 530/25nm

        EM 590/35nm

        (Alexa Fluor 546/CY3)

        EX 544/35nm

        EM 590/35nm

        Ex 525/20nm

        Em 610/30nm

        NIR

        /

        用戶自定義

        /

        EX 584/35nm

        EM 620/10nm

        mCherry,Alexa Fluor 594

        Ex 620/40nm

        Em 690/30nm

        CY5, Alexa Fluor 680

               標配的濾光片不夠用,可能是這類多功能熒光檢測系統的最大短板??v然BMG FluoStar Omega裝備有8位濾光片輪(標配4對檢測濾光片),與QuantStudio 5、QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR儀的6個熒光檢測通道能把Fluorescein, VIC, TAMRA/Cy3, Texas Red,Cy5, Cy5.5五種代表性染料全覆蓋比,也望塵莫及。

               而化解這一困境的辦法其實很簡單。

               用戶可根據主要測試任務和常用試劑盒的熒光染料類別,增配若干個空濾光模塊(每個熒光模塊都具有數量不等的激發-二分鏡-發射濾光組件安裝位置),再從增配相應波長的濾光片就水到渠成。以Synergy LX為例,從310/20nm開始到818/40nm,以波長10或20nm幅度遞增,有數十種濾光片可供選配或定制。

        Synergy Neo2多功能熒光酶標儀可插拔濾光模塊.jpg

               表2也告訴了人們一個基本事實:廠商提供的初始標配大體是一致的,采用的是RGB三色熒光配置。說明,這樣設計可照顧常用染料的熒光測定要求,用戶DIY優化配置的額外工作并不復雜。

         

        2.2 熒光強度檢測常用多功能熒光酶標儀方案

              目前,基于濾光片光路設計的主流品牌多功能熒光酶標儀機型包括了以下幾款。

        表3 多功能熒光酶標儀主要測試性能指標一覽表

        品牌

        型號

        MD

        SpectraMax Mini

        Biotek

        Synergy LX

        Tecan

        Infinite F Plex

        BMG

        FluoStar Omega

        外觀

        SpectraMax Mini多功能熒光酶標儀.jpgsynergy LX多功能熒光酶標儀.jpgInfinite F Plex多功能熒光酶標儀.jpgFluostar Omega多功能熒光酶標儀.jpg

        預裝濾光片數

        3

        3

        自定義

        4

        激發波長(Ex)

        250~850nm

        320~700nm

        230~850nm

        240~740 nm

        發射波長(Em)

        250~850nm

        320~700nm

        280~850nm

        240~740 nm

        熒光檢測器

        低溫PMT

        PMT

        PMT

        PMT

        檢測靈敏度

        1 pmol/well

        fluorescein

        2 pmol/well

         fluorescein

        頂讀0.85 pmol/well

        (100μl, 384孔板)

        底讀5.0 fmol/well

        (200μl,96孔板)

        0.2 fmol/well

        fluorescein

        檢測動態范圍

        6 decades

        6 decades

        /

        8 decades

        恒溫孵育功能

        RT+5℃~45℃

        RT+5℃~50℃

        RT+5℃~42℃

        RT+5℃~45℃

        微孔板振蕩功能

        線性、圓周和雙圓周

        線性、圓周和雙圓周

        線性、圓周

        線性、圓周和雙圓周

        可選配注射器

        (注:1 pmol =103 fmol = 106 amol)

               整體看,表中所列四款機型的測試功能旗鼓相當,都具備熒光強度測定、發光檢測、紫外可見吸光度測定、動力學分析功能,且都有微孔板振蕩模塊和維持樣品室恒溫功能。

               就熒光檢測靈敏度、檢測動態范圍兩項指標而言,BMG公司 FluoStar Omega多功能熒光酶標儀要更勝一籌,其次是Tecan Infinite F Plex。此外,考慮到雙自動進樣器在動力學測定、雙熒光素酶報告基因分析中的重要作用,儀器應用的可擴展性也優于MD SpectraMax Mini、Biotek Synergy LX兩機型。

               根據近年國內公開渠道的信息,Synergy LX、Infinite F Plex兩款機型,標準出廠配置(不含標配之外的光學模塊、實際進樣器)情況下,售價低于30萬元。

         

        參考文獻:

        [1]Omega Family of Readers Operating Manual (Rev G)

        [2]GloMax Explorer System Operating anual (Rev 6/22)

        [3]Instructions for Use for Infinite 200 PRO Rev 1.6

        [4]SpectraMax Mini Multi-Mode Microplate Reader User Guide (5090339 B)

        [5]Synergy 2 Multi-Mode Reader Operator's Manual (Rev K)

        [6]Xavier Amouretti. 多功能微孔板發光酶標儀:基于濾光片系統,基于單色器系統,還是合二為一?

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