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        百家秘籍

        赤橙黃綠青藍紫 誰持彩練當空舞——雙熒光素酶報告基因檢測之多功能熒光酶標儀方案-上

        基于應用的多功能熒光酶標儀選型-2

               熒光素酶報告基因檢測是以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase)活性的一種基因表達調控指示系統。它利用熒光素酶與底物發生化學中會產生發光的特性,把感興趣的基因轉錄調控元件(如啟動子基因片段、靶基因3’UTR等)克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游,構建熒光素酶報告基因質粒,然后轉染細胞。經適當實驗刺激或處理后,測定熒光素酶-熒光素反應發光的強弱(代表熒光素酶活性的高低),來判斷實驗刺激/處理對基因表達調控元件的影響。

               1996年,Promega公司在單一熒光素酶報告基因的基礎上引入“內參對照”——海腎熒光素酶(Renilla Luciferase)報告基因,推出了雙熒光素酶報告基因檢測系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System,DLR)。

         雙熒光素酶報告基因檢測系統DLR基本原理示意圖.jpg

               DLR檢測系統既可以是將分別帶有海腎熒光素酶基因的質粒、含靶基因調控元件片段的螢火蟲熒光素酶報告基因的兩種質粒共同轉染細胞,也可以是將各自帶啟動子的兩種熒光素酶報告基因構建到同一個質粒上轉染細胞,再測定兩種熒光素酶活性。將熒光素酶報告基因轉錄的活性相對于內參——海腎熒光素酶基因表達的活性做歸一化處理,以消除因細胞活性、轉染效率差異、移液體積、細胞裂解效率和檢測效率等其他因素造成的實驗變異,提高了實驗數據的可靠性。

               DLR檢測系統具有靈敏度高、動態范圍廣的優勢,被廣泛用于基因轉錄因子與啟動子轉錄調控機制、非編碼RNA靶向互作、啟動子結構分析、信號通路分析等研究領域。

               DLR檢測中需按特定操作流程和測度時間要求,依次檢測兩種不同的熒光素酶與各自底物結合發生化學反應釋放的化學發光信號。為確保測試性能,Promega公司創建了一整套DLR測試標準體系,并開發出GloMax20/20、GloMax 96、GloMax Multi、GloMax Navigator、GloMax ExplorerGloMax Discover等一系列配套發光檢測儀。

               以“Dual-Luciferase Reporter Assay[Text Word] ”為條件檢索PubMed期刊論文數據庫,查到的文獻記錄達36793條之多。然而,這數萬余篇實驗論文中,DLR測試用GloMax系列機型的占比不到1/4,超過3/4的DLR分析實驗是在MD、BioTek、Tecan、BMG等主流品牌的多功能酶標儀上完成。

               這種墻內開花墻外香現象的出現,既彰顯DLR分析技術應用之盛,也說明DLR標準體系已被眾多品牌多功能酶標儀系統采納和引進,從而進一步促進了DLR檢測推廣。

               由此,我們來討論3個問題:DLR有何特殊檢測流程,DLR對測試儀器有何特殊要求,有哪些經濟型多功能熒光酶標儀可作為DLR的解決方案?

        一、 DLR檢測標準流程的特殊性

               螢火蟲熒光素酶在細胞內轉錄后無需翻譯后加工即具有酶活性,在氧氣、ATP和鎂離子協同下,催化甲蟲螢光素發生氧化反應。此過程中,部分能量以“閃光”型黃綠色(波長550-570nm)光信號的形式釋放,在底物和酶混合后會迅速衰減。通過在試劑中添加含輔酶A (Coenzyme A, CoA),則反應的發光由閃光轉變為穩定可持續的輝光信號,且強度高,便于手工操作檢測。海腎熒光素酶則在氧氣存在時催化腔腸素發生氧化產生穩定的藍光信號。

        螢火蟲和海腎螢光素酶在DLR檢測中的發光動力曲線.jpg

               故標準DLR檢測流程中,發光檢測儀讀數步驟程序設置為進樣后2秒開始采集光信號(For the standard DLR? Assay, we recommend programming luminometers to provide a 2-second pre-read delay, followed by a 10-second measurement period.)。

               由于這兩種熒光素酶催化反應中的發光光譜分布寬泛,可見光譜區段存在重疊。故promega的DLR檢測采用的是4步操作流程:

        步  驟

        操  作

        所需時間

        Step-1

        將細胞裂解物加入已添加Luciferase Assay Reagent II的發光檢測管中,混勻

        約3秒

        Step-2

        檢測螢火蟲螢光素酶活性

        12秒

        Step-3

        添加 Stop & Glo 試劑(以淬滅Firefly   Luciferase光信號并激活Renilla Luciferase反應),混勻

        約3秒

        Step-4

        檢測海腎螢光素酶活性

        12秒

               不帶自動進樣器配置的GloMax 20/20系統操作程序界面顯示,發光測讀步驟工作模式是1秒鐘一次,共采集10次發光信號,每次PMT采集持續時間為1秒。

        GloMax 20/20發光檢測儀操作程序界面.jpg

               配置有1或2個自動進樣器時,系統控制程序界面顯示,每個進樣操作完成后有2秒時間延遲,然后開始測讀發光信號。信號測度分為2個步驟,每個步驟都是間隔時間1秒共進行10次測讀,單次信號測讀時間1秒。

        GloMax 20/20雙熒光素酶報告基因檢測標準控制程序.jpg

               為高通量DLR檢測開發的發光酶標儀GloMax Navigator、多功能熒光酶標儀GloMax Explorer的系統的內置控制程序中,整合有Dual-Luciferase Reporter Assay System操作流程,可以直接調用。

        GloMax Explorer多功熒光能酶標儀DLR檢測標準程序.jpg

               DLR檢測標準程序不僅適用于Promega自創發光酶標儀、多功能熒光酶標儀。作為獨立功能模塊,還通過認證合作,嵌入到多個品牌的熒光酶標儀系統控制軟件中。

               借助于儀器預置的DLR標準化程序,系統可在“開始”指令后自動進行加樣并依次讀取螢火蟲和海腎螢光素酶活性數值,避免手動記錄測量值而暫停檢測操作。軟件還提供歸一化的螢光素酶值計算功能,并可對組內測定值進行統計分析。

               采用GloMax 20/20發光檢測儀純手動操作,完成每管樣品的檢測耗時約為30秒。期間因需手動記錄螢火蟲熒光素酶活性檢測數據,勢必造成步驟3、4操作的延遲。故配備外置電腦控制雙進樣器移液、并自動記錄測試值,顯然是必要的。對于高通量測試實驗系統,則更應如此。

        (待續:雙熒光素酶報告基因檢測之多功能熒光酶標儀解決方案-下) 

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